Técnica que facilita la iluminación uniforme y el excelente contraste de la muestra
La iluminación crítica fue la técnica predominante en la microscopía hasta que August Köhler (1866–1948) desarrolló un nuevo método de iluminación, conocido hoy como iluminación Köhler. El problema con la iluminación crítica era que la fuente de la lámpara de luz brillante creaba una imagen de filamentos en el mismo plano que la imagen de la muestra. La visibilidad del filamento de la bombilla en la imagen final causaba una iluminación irregular en la muestra y creaba deslumbramiento y sombras. La iluminación Köhler resuelve estos problemas mediante una fuente de luz desenfocada que proporciona una iluminación uniforme a la muestra.
Aún esencial hoy en día, la iluminación Köhler debe ser aplicada donde cualquier iluminación deficiente en la muestra impide su observación adecuada. La iluminación Köhler puede brindar una iluminación uniforme de las muestras en campo claro, campo oscuro y en todas las variaciones de microscopía óptica de contraste de fase mediante el uso de los recorridos de luz transmitida y reflejada. La iluminación Köhler facilita la iluminación uniforme, la alta resolución y el buen contraste de la muestra.
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Imagen capturada con microscopía óptica de luz reflejada.
La imagen superior fue capturada con la iluminación Köhler y la inferior con la iluminación Köhler. |
¿Cómo se configura y usa la iluminación Köhler?
Microscopía óptica de luz transmitida: La iluminación Köhler requiere varios componentes ópticos del microscopio para intervenir entre la fuente de luz y la muestra. Entre estos componentes se incluye el colector (lente), el diafragma de campo, el diafragma del condensador y el condensador (lente). El colector recupera la luz a partir de la fuente de luz y la enfoca en el plano del diafragma del condensador. Después, el condensador proyecta esta luz a través de la muestra.
Mediante el ajuste del diafragma de campo, la imagen de la apertura del diafragma de campo, en el plano de la muestra, es ajustada a un tamaño ligeramente superior que el de la región proyectada de la muestra, lo cual corresponde a la porción de la imagen de la muestra vista a través del punto de campo de visión del ocular. Debido a que el diafragma de campo, la muestra y el punto de campo de visión del ocular se sitúan en el mismo plano de proyección de imagen conjugado, este ajuste permite que los rayos de iluminación completen el campo de visión del ocular, mientras la cantidad de luz externa bloqueada es minimizada por el punto de campo de visión del ocular.
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Microscopía óptica de luz reflejada: La microscopía óptica de luz reflejada o iluminación episcópica es la opción ideal para la iluminación de especímenes opacos como: metales, menas, cerámicos, polímeros, semiconductores (p. ej., silicio en bruto, obleas, circuitos integrados), escoria, carbón, plásticos y pintura.
Los componentes ópticos clave para la configuración de la iluminación Köhler en la microscopía óptica de luz reflejada se encuentran ubicados en la orientación opuesta a aquella de la microscopía óptica de luz transmitida. El diafragma del iris de apertura del condensador está más cerca de la fuente de luz, y el diafragma del iris de campo está más cerca de la muestra. En la microscopía óptica de luz reflejada, el objetivo tiene dos funciones. En su recorrido hacia abajo, el objetivo sirve como un condensador alineado apropiadamente para controlar el ángulo de la luz que choca con la muestra. En su recorrido hacia arriba, la apertura numérica (A. N.) del objetivo determina el ángulo de luz que puede ser capturado después de ser reflejado a partir de la muestra. Por otra parte, mientras más amplia sea la apertura numérica (A. N.), mejor será la resolución del objetivo y la resolución de la muestra.
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| Configuración típica para un microscopio óptico de luz reflejada |
¿Cómo se aplican las técnicas de iluminación Köhler?
Microscopía óptica de campo claro: Generalmente, es la técnica de microscopía óptica más usada. La iluminación de la muestra es transmitida desde arriba mediante la lámpara halógena de tungsteno, centrada gracias al iluminador vertical que se encuentra ubicado sobre la platina. La luz reflejada por un divisor de haz a través del objetivo ilumina la muestra. La luz reflejada a partir de la superficie de la muestra ingresa nuevamente al objetivo y pasa al interior del ocular o a un puerto de cámara. La absorción y la difracción de la luz incidente, que se da en la muestra, conlleva generalmente a variaciones discernibles en la imagen. Los especímenes que muestran pequeñas diferencias en intensidad o color requieren una microscopía óptica de campo oscuro o un contraste de interferencia diferencial reflejada (DCI, por sus siglas en inglés) [vea más a continuación].
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| Imagen de un microchip bajo observación de campo claro |
Microscopia óptica de campo oscuro: Es ideal para las aplicaciones donde el contraste proviene a partir de la luz dispersada por la muestra. La luz que no ha sido dispersada por la muestra no es considerada por la lente de objetivo ni incorporada en la imagen. Por ende, el campo, alrededor de la muestra, aparece oscuro. La principal limitación de la microscopía de campo oscuro es el bajo nivel de luz visualizado en la imagen final. Y, es en ese aspecto que contribuirán las técnicas de iluminación Köhler, ya que la muestra debe estar iluminada intensamente. Con rasgos en relieve que son muy tenues para interpretar, las sombras no aparecerán en las imágenes de campo claro; sin embargo, la luz reflejada fuera de las áreas del rasgo podrán ser visibles en las imágenes de campo oscuro.
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| Imagen de un microchip bajo observación de campo oscuro |
Microscopía óptica de contraste de fase: La técnica de microscopía óptica genera el contraste de la muestra a partir de la interferencia entre las diferentes longitudes del recorrido de luz reflejada a partir de la muestra. El cambio de amplitud y fase se produce en las propiedades de la muestra. Estos cambios se muestran como variaciones en la iluminación desde la dispersión y absorción de la luz. La microscopía óptica de contraste de fase es particularmente importante en la microscopía industrial debido a que revela muchas características o estructuras del espécimen que no son visibles con la microscopía de campo claro.
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| Imagen de metal pulido transversalmente bajo la observación de campo claro con ningún contraste de fase (superior) y con contraste de fase (inferior). |
Contraste de interferencia diferencial (Microscopía DIC): Es un nuevo método de contraste de imagen. La microscopía DIC mejora el contraste mediante la creación de sombras artificiales, como si el objeto estuviese siendo iluminado lateralmente. Para lograr la microscopía DIC, la luz polarizada debe separarse en dos partes polarizadas ortogonales (o perpendiculares). Las partes mutuamente coherentes, que se encuentran espacialmente desplazadas (cizalladas) en el plano de la muestra, después son combinadas nuevamente antes de la observación. La interferencia de las dos partes en la nueva combinación es sensible a las diferencias de sus recorridos ópticos, es decir al producto de sus índices refractivos y longitudes geométricas del recorrido. El contraste observado es proporcional a la longitud pendiente del recorrido a lo largo de la dirección transversal, lo que da la apariencia de un relieve físico tridimensional.
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| Imagen de un metal pulido transversalmente bajo la observación de campo claro sin DIC (superior) y con DIC (inferior) aplicada. |
