Une technique qui favorise l’uniformité de l’éclairage et l’excellence du contraste
Dans le domaine de la microscopie, la technique d’illumination critique est restée prédominante jusqu’à ce qu’August Köhler (1866–1948) développe une nouvelle méthode appelée « illumination de Köhler ». L’illumination critique utilisait une source lumineuse éblouissante, souvent une ampoule, ce qui posait problème. En effet, l’image de la source lumineuse, dans laquelle était visible le filament de l’ampoule, se superposait à l’image de l’échantillon. La présence du filament dans l’image finale provoquait un éclairage irrégulier et éblouissant, en plus de créer des zones d’ombre. L’illumination de Köhler règle ces problèmes grâce à une source lumineuse défocalisée qui uniformise l’illumination.
Toujours pertinente aujourd’hui, l’illumination de Köhler doit être exploitée chaque fois que l’éclairage nuit à l’observation. L’illumination de Köhler éclaire uniformément les échantillons sur fond clair et sur fond noir, ainsi que toutes les variations de la microscopie à contraste de phase en lumière transmise ou incidente. Cette technique favorise un éclairage uniforme, une haute résolution et un bon contraste.
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| Image prise en lumière incidente : celle du haut n’utilise pas l’illumination de Köhler, alors que celle du bas, oui. |
Réglage et fonctionnement de l’illumination de Köhler
Microscopie par lumière transmise: la technique d’illumination de Köhler utilise plusieurs composants optiques entre la source lumineuse et l’échantillon observé. Notamment, la lentille collectrice, le diaphragme de champ, le diaphragme-iris et la lentille de condenseur. La lentille collectrice sert à concentrer la lumière sur la surface du diaphragme-iris. La lentille de condenseur projette ensuite cette lumière sur l’échantillon.
L’ouverture du diaphragme dans le plan de l’échantillon est configurée de manière à être légèrement plus grande que l’image observée et pour correspondre à la partie de l’échantillon située à l’intérieur des limites du champ de vue et visible à l’aide des oculaires. Comme le diaphragme de champ, l’échantillon et l’oculaire se rejoignent dans le même plan d’image conjuguée, ce réglage permet à la source lumineuse de remplir tout le champ de l’oculaire, minimisant ainsi la quantité de lumière extérieure bloquée par le diaphragme de champ de l’oculaire.
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Microscopie en lumière incidente : la microscopie en lumière incidente, ou épi-illumination, constitue le choix judicieux pour éclairer des échantillons opaques, comme les métaux, le minerai, les céramiques, les polymères, les semiconducteurs (silicium non traité, wafers, circuits intégrés), laitiers, charbon, plastiques et peinture.
En lumière incidente, les composants optiques essentiels requis pour régler l’illumination de Köhler sont disposés selon une orientation inverse à celle utilisée en lumière transmise. Le diaphragme d’ouverture du condenseur est tout près de la source lumineuse et le diagramme-iris de champ est tout près de l’échantillon. En microscopie en lumière incidente, l’objectif revêt une double fonction : vers le bas, il sert de condenseur correctement aligné qui contrôle l’angle de la lumière qui frappe l’échantillon; vers le haut, l’ouverture numérique de l’objectif détermine l’angle de la lumière qui peut être captée en provenance de l’échantillon. Par ailleurs, toutes choses étant égales, plus l’ouverture numérique est importante, plus la résolution offerte par l’objectif est excellente, ce qui améliore la finesse de l’image.
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| Réglage typique pour la microscopie en lumière incidente |
Comment appliquer les techniques de l’illumination de Köhler ?
Microscopie sur fond clair: Technique la plus courante en microscopie optique. L’éclairage de l’échantillon est transmis par le haut par une lampe tungstène-halogène dont la lumière est focalisée au travers de l’illuminateur vertical placé au-dessus de la platine. La lumière réfléchie par le séparateur de faisceau au travers de l’objectif éclaire l’échantillon. La lumière réfléchie à la surface de l’échantillon réintègre l’objectif et se faufile dans l’oculaire ou le port caméra. L’absorption et la diffraction de la lumière incidente par l’échantillon occasionnent souvent des variations perceptibles dans l’image. Les échantillons affichant une petite différence d’intensité ou de couleur exigent l’utilisation de la microscopie sur fond noir ou de l’observation par contraste interférentiel différentiel (differential interference contrast, DIC) [voir ci-dessous].
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| Observation d’une micropuce sur fond clair |
Microscopie sur fond noir : Technique parfaitement adaptée lorsque le contraste provient de la lumière dispersée par l’échantillon. La lumière qui n’est pas dispersée par l’échantillon n’est pas captée par la lentille d’objectif et ne peut être intégrée à l’image. Par conséquent, le champ autour de l’échantillon semble foncé. La limitation principale de la microscopie sur fond noir est le faible niveau de luminosité observé dans l’image finale. Et c’est ici que l’illumination de Köhler apporte sa contribution : l’échantillon doit être fortement éclairé. Les éléments en relief trop uniformes pour créer des ombres ne seront pas visibles dans les images sur fond clair, mais la lumière réfléchie des côtés de ces éléments sera visible dans les images sur fond noir.
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| Observation d’une micropuce sur fond noir |
Microscopie à contraste de phase: Technique de microscopie optique qui crée un contraste d’échantillon à partir de l’interférence entre les différentes longueurs de trajets de la lumière réfléchie par l’échantillon. Des décalages d’amplitude et de phase se produisent selon les propriétés de l’échantillon. Ces modifications sont présentées comme des variations de luminosité dues à la diffusion et à l’absorption de la lumière. La technique par contraste de phase est particulièrement importante en microscopie industrielle, car elle permet de révéler plusieurs éléments ou structures d’un échantillon qui seraient impossibles à observer sur fond clair.
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| Coupe transversale de métal poli observée sur fond clair sans contraste de phase (en haut) et avec contraste de phase (en bas) |
Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC, differential interference contrast) : une nouvelle technique d’imagerie à contraste de phase. La microscopie à contraste interférentiel différentiel accentue le contraste en créant des ombrages artificiels, comme si l’objet était illuminé de côté. Cette technique divise la lumière polarisée en deux sections de polarisation orthogonale. Les sections mutuellement cohérentes, qui sont divisées (éloignées) dans le plan de l’échantillon, sont ensuite réunies avant l’observation. À la recombinaison des deux parties du faisceau, il faut tenir compte des différences de leur trajectoire optique respective, c’est-à-dire le produit de la différence entre leur indice de réfraction et la longueur de leur trajet géométrique. En effet, il faut ramener les vibrations des deux parties dans le même plan et sur le même axe. Le contraste observé est proportionnel au gradient de la longueur du trajet en direction transversale, ce qui donne l’apparence d’un relief tridimensionnel.
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| Coupe transversale de métal poli observée sur fond clair sans contraste interférentiel différentiel (en haut) et avec contraste interférentiel différentiel (en bas) |
